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实时荧光定量PCR具体实验步骤
来源:本站 发布日期:2015-7-28 点击次数:1027 [打印] [收藏]

1 样品RNA的抽提

①取冻存已裂解的细胞,室温放置5分钟使其完全溶解。

②两相分离 每1ml的TRIZOL试剂裂解的样品中加入0.2ml的氯仿,盖紧管盖。手动剧烈振荡管体15秒后,15到30℃孵育2到3分钟。4℃下12000rpm离心15分钟。离心后混合液体将分为下层的红色酚氯仿相,中间层以及无色水相上层。RNA全部被分配于水相中。水相上层的体积大约是匀浆时加入的TRIZOL试剂的60%。

③RNA沉淀 将水相上层转移到一干净无RNA酶的离心管中。加等体积异丙醇混合以沉淀其中的RNA,混匀后15到30℃孵育10分钟后,于4℃下12000rpm 离心10分钟。此时离心前不可见的RNA沉淀将在管底部和侧壁上形成胶状沉淀块。

④RNA清洗 移去上清液,每1mlTRIZOL试剂裂解的样品中加入至少1ml的75%乙醇(75%乙醇用DEPCH2O配制),清洗RNA沉淀。混匀后,4℃下7000rpm离心5分钟。

⑤RNA干燥 小心吸去大部分乙醇溶液,使RNA沉淀在室温空气中干燥5-10分钟。

⑥溶解RNA沉淀 溶解RNA时,先加入无RNA酶的水40μl用枪反复吹打几次,使其完全溶解,获得的RNA溶液保存于-80℃待用。

2 RNA质量检测

1)紫外吸收法测定

先用稀释用的TE溶液将分光光度计调零。然后取少量RNA溶液用TE稀释(1:100)后,读取其在分光光度计260nm和280nm处的吸收值,测定RNA溶液 浓度和纯度。

① 浓度测定

A260下读值为1表示40 ?g RNA/ml。样品RNA浓度(?g/ml)计算公式为:A260 ×稀释倍数× 40 ?g/ml。具体计算如下:

RNA溶于40 ?l DEPC水中,取5ul,1:100稀释至495?l的TE中,测得A260 = 0.21

RNA 浓度= 0.21 ×100 ×40 ?g/ml = 840 ?g/ml 或 0.84 ?g/?l

取5ul用来测量以后,剩余样品RNA为35 ?l,剩余RNA总量为:

35 ?l × 0.84 ?g/?l = 29.4 ?g

②纯度检测

RNA溶液的A260/A280的比值即为RNA纯度,比值范围1.8到2.1。

2)变性琼脂糖凝胶电泳测定

①制胶

1g琼脂糖溶于72ml水中,冷却至60℃,10 ml的10× MOPS电泳缓冲液和18 ml的37% 甲醛溶液(12.3 M)。

10×MOPS电泳缓冲液

浓度  成分

0.4M  MOPS,pH 7.0

0.1M  乙酸钠

0.01M  EDTA

灌制凝胶板,预留加样孔至少可以加入25 ?l溶液。胶凝后取下梳子,将凝胶板放入电泳槽内,加足量的1×MOPS电泳缓冲液至覆盖胶面几个毫米。

②准备RNA样品

取3?gRNA,加3倍体积的甲醛上样染液,加EB于甲醛上样染液中至终浓度为10?g/ml。加热至70℃孵育15分钟使样品变性。

③电泳

上样前凝胶须预电泳5min,随后将样品加入上样孔。5-6V/cm电压下2h,电泳至溴酚兰指示剂进胶至少2-3cm。

④紫外透射光下观察并拍照

28S和18S核糖体RNA的带非常亮而浓(其大小决定于用于抽提RNA的物种类型),上面一条带的密度大约是下面一条带的2倍。还有可能观察到一个更小稍微扩散的带,它由低分子量的RNA(tRNA和5S核糖体RNA)组成。在18S和28S核糖体带之间可以看到一片弥散的EB染色物质,可能是由mRNA和其它异型RNA组成。RNA制备过程中如果出现DNA污染,将会在28S核糖体RNA带的上面出现,即更高分子量的弥散迁移物质或者带,RNA的降解表现为核糖体RNA带的弥散。用数码照相机拍下电泳结果。

3 样品cDNA合成

①反应体系

序号  反应物  剂量

1  逆转录buffer  2μl

2  上游引物  0.2μl

3  下游引物  0.2μl

4  dNTP  0.1μl

5  逆转录酶MMLV  0.5μl

6  DEPC水  5μl

7  RNA模版  2μl

8  总体积  10μl

轻弹管底将溶液混合,6000rpm短暂离心。

②混合液在加入逆转录酶MMLV 之前先70℃干浴3分钟,取出后立即冰水浴至管内外温度一致,然后加逆转录酶0.5μl,37℃水浴60分钟。

③取出后立即95℃干浴3分钟,得到逆转录终溶液即为cDNA溶液,保存于-80℃待用。

4 梯度稀释的标准品及待测样品的管家基因(β-actin)实时定量PCR

①β-actin阳性模板的标准梯度制备 阳性模板的浓度为1011,反应前取3μl按10倍稀释(加水27μl并充分混匀)为1010,依次稀释至109、108、107、106、105、104,以备用。

②反应体系如下:

标准品反应体系

序号  反应物  剂量

1   SYBR Green 1 染料  10μl

2  阳性模板上游引物F  0.5μl

3  阳性模板下游引物R  0.5μl

4  dNTP  0.5μl

5  Taq酶  1μl

6  阳性模板DNA  5μl

7  ddH2O  32.5μl

8  总体积  50μl

轻弹管底将溶液混合,6000rpm短暂离心。

管家基因反应体系:

序号  反应物  剂量

1  SYBR Green 1 染料  10μl

2  内参照上游引物F  0.5μl

3  内参照下游引物R  0.5μl

4  dNTP  0.5μl

5  Taq酶  1μl

6  待测样品cDNA  5μl

7  ddH2O  32.5μl

8  总体积  50μl

轻弹管底将溶液混合,6000rpm短暂离心。

③制备好的阳性标准品和检测样本同时上机,反应条件为:93℃ 2分钟,然后93℃ 1分钟,55℃ 2分钟,共40个循环。

5 制备用于绘制梯度稀释标准曲线的DNA模板

①针对每一需要测量的基因,选择一确定表达该基因的cDNA模板进行PCR反应。

反应体系:

序号  反应物  剂量

1  10× PCR缓冲液  2.5 ul

2  MgCl2 溶液  1.5 ul

3  上游引物F  0.5 ul

4  下游引物R  0.5 ul

5  dNTP混合液  3 ul

6  Taq聚合酶  1 ul

7  cDNA  1 ul

8  加水至总体积为  25ul

轻弹管底将溶液混合,6000rpm短暂离心。

35个PCR循环(94℃1分钟;55℃1分钟;72℃1分钟); 72?C延伸5分钟。

②PCR产物与 DNA Ladder在2%琼脂糖凝胶电泳,溴化乙锭染色,检测PCR产物是否为单一特异性扩增条带。

③将PCR产物进行10倍梯度稀释: 将PCR产物进行10倍梯度稀释: 设定PCR产物浓度为1×1010,依次稀释至109、108、107、106、105、104几个浓度梯度。

6 待测样品的待测基因实时定量PCR

①所有cDNA样品分别配置实时定量 PCR反应体系。

体系配置如下:

序号  反应物  剂量

1  SYBR Green 1 染料   10 ul

2  上游引物  1ul

3  下游引物  1ul

4  dNTP   1ul

5  Taq聚合酶  2ul

6  待测样品cDNA  5ul

7  ddH2O   30ul

8  总体积  50 ul

轻弹管底将溶液混合,6000rpm短暂离心。

②将配制好的PCR反应溶液置于Realtime PCR仪上进行PCR扩增反应。反应条件为:93℃2分钟预变性,然后按93℃ 1分钟,55℃1分钟,72℃1分钟,共40做个循环,最后72℃7分钟延伸。

7 实时定量PCR使用引物列表

引物设计软件:Primer Premier 5.0,并遵循以下原则:引物与模板的序列紧密互补;引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构;引物不在模板的非目的位点引发DNA 聚合反应(即错配)。

8 电泳

各样品的目的基因和管家基因分别进行Realtime PCR反应。PCR产物与 DNA Ladder在2%琼脂糖凝胶电泳,GoldView?染色,检测PCR产物是否为单一特异性扩增条带。

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